Op 26 januari kregen we het bezoek van Peter de Batist. Hij kwam ons uit de doeken doen met welke techniek veel kwekers van aquariumplanten werken om een snelle manier aan veel planten te geraken.
Reeds in de jaren ’80 had Peter al drie aquaria staan, speciaal voor de kweek van aquariumplanten. De getoonde diareeks was een reportage van de techniek voor de aquariumverenigingen.
In-vitro-cultuur is niet meer dan de kweek in glas. We denken aan de manier waarop Louis Pasteur en Robert Koch in buisjes, kolven en petrischaaltjes bacteriën isoleerden en kweekten en zo de basis legden van de bacteriologie . Glas is een goed materiaal om recipiënten van te maken: inert, gemakkelijk te reinigen en hittebestendig, zodat het goed gesteriliseerd kan worden.
Waar eerst de planten die bestemd waren voor het aquarium geoogst werden in de landen van herkomst en naar hier getransporteerd, zag met snel in dat met het kweken van deze planten een stabielere aanvoer en planten van betere kwaliteit en prijs konden geleverd worden. Sommige planten waren eerder eenvoudig te kweken, maar bijvoorbeeld cryptocorynen waren nauwelijks met zaad verder te kweken. De vegetatieve kweek met scheutjes en worteloogjes ging ook maar traag.
In 1839, lang voor de ontdekking van DNA kwamen Theodore Schwann en Matthias Jacob Schleiden tot de multipotentie theorie: de kweek van één geïsoleerde cel kan leiden tot een volledige plant, omdat elke cel de volledige blauwdruk van de plant in zich draagt. Gebaseerd op deze theorie bekwam Gottlieb Haberlandt op basis van een rudimentaire voedingsbodem de ontwikkeling van klompjes plantencellen. In 1907 verbeterden Carell, Burow en Howe de voedingsbodems, maar stoffen om de groei te sturen ontbraken nog.
Met de fertilisatie van orchideeën kwam een volgende stap. Deze zaadjes bevatten geen reserveweefsel, waardoor het opkweken van kiemplantjes een moeilijke zaak is. De oplossing van Knopp, met toevoeging van glucose als energiebron maakte dit mogelijk.
Met de ontdekking van de plantenhormonen kwam de volgende stap: Giberilinen ontstaan in zaden wanneer de omstandigheden voor kiemen goed zijn, zorgen voor het uitlopen van slapende scheuten en zetten reservezetmeel om in een voor de planten bruikbare energiebron. Auxines zetten aan tot de vorming van wortels.
Met deze phytohormonen werden verschillende voedingsbodems ontwikkeld, waarmee de kweek van stukjes plantenwortel tot plantjes mogelijk bleek. Het doel van deze experimenten was de honger in de wereld te lenigen.
In 1955 werden de cytokinen door Folke K. Skoog geïsoleerd uit kokosmelk, toen een onontbeerlijk ingrediënt van de kweekbodems.
Het Murashige en Skoog medium zou de basis vormen van de kweek van plantaardige cellen. Door klonen kon zo een grote voorraad genetisch identieke plantjes gekweekt worden.
De vegetatieve voortplanting zien we frequent n het aquarium: Als Vallisneria of Saggitaria uitlopers vormen, als er plantjes op de bloeistengels van de zwaardplanten ontstaan, krijgen we genetisch identieke plantjes. Maar ook met scheuten, die we op moeraskultuur kweken en bij het stekken van onze stengelplanten gaat het om een vegetatieve vermenigvuldiging.
De generatieve vermenigvuldiging, door middel van zaad, is voor de meeste aquariumplanten minder evident. Uitzondering daarop is de Samolus floribundus, of het ‘slaplantje’ waarvan de uitbundige bloei ook een overvloedige zaadzetting met zich meebrengt. Ook Barclaya longifolia, Aponogeton en sommige Echinodorussoorten alsook de tijgerlotus kunnen in het aquarium tot zaadvorming komen, maar ook dan is het ver van eenvoudig om de jonge kiemplantjes op te kweken.
De kweek in het laboratorium is een derde weg, die uitgaande van een beperkte hoeveelheid plantenmateriaal, na een weliswaar ingewikkelde manipulatie, tot veel bruikbare planten op een relatief korte periode kan leiden.
Wat hebben we nodig voor deze in-vitro-kweek?
Javelwater om het plantenmateriaal grondig te ontsmetten.
Ontsmettingsalcohol om de tafels en werkbladen te ontsmetten.
Gedemineraliseerd water, Agar agar om de voedingsbodem vast te maken, glucopur als energiebron voor de cellen, een nauwkeurig weegschaaltje op de hoeveelheden benodigde voedingsstoffen af te wegen, watten, zilverpapier om de reageerbuizen af te dekken, glaswerk: erlenmeyer, reageerbuizen, roerstaven, bovendien een pipet om precies hoeveelheden vloeistof af te meten en een inox pincet en bistouri om de plantendelen te manipuleren en te verkleinen.
Een labojas is onontbeerlijk om het risico op besmetting van de culturen te beperken, én om de schade onder meer door Javel aan de kledij te vermijden.
Tot slot is een autoclaaf nodig om de bereide voedingsbodem op hoge temperatuur te steriliseren, zodat er geen schimmels, bacteriën of virussen de kweek in het gedrang kunnen brengen.
Het groeimedium van Murashige-Skoog (MSO) is een standaard in plantencelkweek. Het bevat achttien ingrediënten in exact de juiste verhoudingen en is kant-en klaar te koop.
Samenstelling MSO
Macronutriënten
· Ammonium nitraat (NH4NO3) 1,650 mg/l
· Calcium chloride (CaCl2 · 2H2O) 440 mg/l
· Magnesium sulfaat (MgSO4 · 7H2O) 370 mg/l
· Kalium fosfaat (KH2PO4) 170 mg/l
· Kalium nitraat (KNO3) 1,900 mg/l
Micronutriënten
· Boorzuur (H3BO3) 6.2 mg/l
· Kobalt chloride (CoCl2 · 6H2O) 0.025 mg/l
· Koper sulfaat (CuSO4 · 5H2O) 0.025 mg/l
· Yzersulfaat (FeSO4 · 7H2O) 27.8 mg/l
· Mangaan sulfaat (MnSO4 · 4H2O) 22.3 mg/l
· Kalium iodide (KI) 0.83 mg/l
· Natrium molybdaat (Na2MoO4 · 2H2O) 0.25 mg/l
· Zink sulfaat (ZnSO4·7H2O) 8.6 mg/l
· Natrium edetaat (Na2EDTA · 2H2O) 37.2 mg/l
Vitaminen en aminozuren
· l-Inositol 100 mg/l
· Niacine 0.5 mg/l
· Pyridoxine · HCl 0.5 mg/l
· Thiamine · HCl 0.1 mg/l
· Glycine 2 mg/l
De plantenhormonen hebben een belangrijke rol in de stimulatie en regeling van de groei. Indolboterzuur (IBA) en benzyladenine (BA) zijn de belangrijkste. Omdat ze in zeer lage dosissen toegediend moeten worden is het handig om een stockoplossing te maken van 1 g/l. Eén milliliter oplossing bevat dan één milligram actieve stof.
Tot slot houden we standaardoplossingen natriumhydroxide en zoutzuur voorradig om de zuurtegraad van de voedingsoplossing eventueel bij te sturen.
De bereiding van de voedingsbodem
Voor we beginnen wordt het glaswerk grondig gereinigd en herhaaldelijk met zuiver water gespoeld en daarna gedroogd.
In een recipiënt wordt in de helft van de vloeistof de juiste hoeveelheden van volgende stoffen opgelost:
Murashige en Skoog medium 4,4 g
glucose 20 g
agar 12 g
Benzyladenine 0,5 mg
Indolboterzuur 1 mg
Dit mengsel wordt aan de kook gebracht, en na volledige oplossing van de ingrediënten verder aangevuld tot een volume van één liter. De zuurtegraad wordt gecontroleerd en bijgesteld tot pH 5,8. Na verdeling in de reageerbuizen en afsluiten met een wattenprop, waarover een kapje aluminiumfolie, plaatsen we deze in een autoklaaf of stoomkoker om de voedingsbodem te steriliseren op 120 °C bij een overdruk van 1 atmosfeer.
Na afkoeling hebben we een gelatineuze bodem in de buisjes, klaar om ons plantenmateriaal in te planten.
Om een cultuur op te starten kunnen in theorie alle cellen in aanmerking komen, maar de meristeemcellen hebben de beste groeimogelijkheden, omdat zij minder gedifferentieerd zijn. Vooral jonge plantenweefsels, wortels en stolonen zijn rijk aan deze cellen. Steriel werken is noodzakelijk bij de voorbereiding en het planten van de plantendelen, besmetting met bacteriën of schimmels is fataal. De plantendelen worden aan de buitenzijde, die met algen en bacteriën beladen is, gereinigd door ze tien minuten in een oplossing 1/10 Javelwater te dompelen. Hierna worden deze stukken enkel nog met steriele instrumenten gemanipuleerd. Na spoelen in steriel water zijn de plantendelen klaar voor verdere behandeling.
Omdat steriel werken zo belangrijk is, worden ringen, horloges en armbanden verwijderd, en wassen we handen, wanden en werkvlak met ontsmettingsalcohol. Een labojas, steriele handschoenen en een mondmasker zijn aan te bevelen.
We plaatsen alle benodigdheden binnen handbereik: links op de tafel de gesteriliseerde bodems, een bekertje met alcohol om scalpel en pincet regelmatig te ontsmetten, een bunsenbrander of spiritusbrander om de instrumenten en recipiënten “af te vlammen”, zodat ze droog en steriel zijn. Centraal plaatsen we een glasplaat met daarop een gesteriliseerd vloeipapier. Daarop worden de plantendelen in stukjes van ongeveer één cm gesneden. Eens een reeks stukjes gesneden zijn, worden deze in de buisjes geplaatst met de volgende techniek, bekend uit de bacteriologie.
In de linkerhand nemen we een reageerbuis met gel, met de rechterhand nemen we met de pincet een stukje plant. We nemen de watten, die het buisje afsluit met de pink vast, openen het recipiënt en plaatsen met de pincet het stukje plant in de voedingsgel. Dan plaatsen we de wattenprop terug en zetten het buisje in een ander rekje. Al deze bewegingen trachten we zo rustig en geleidelijk mogelijk uit te voeren, zodat luchtverplaatsingen vermeden worden. Dan nemen we het volgende buisje…
Als alle cultuurbuisjes klaar zijn, plaatsen we ze in een incubator, een aquarium of terrarium, dat verwarmd wordt op 25 °C en dat gedurende 16 u per dag verlicht wordt met TL ‘daglicht’. Als alles goed evolueert, kunnen we na ongeveer twee maand denken aan uitplanten.
Helaas kan er heel wat misgaan: als de ontsmetting onvoldoende is, of er is besmetting bij de manipulatie, groeien er schimmels in plaats van plantjes. Is de ontsmetting te grondig gebeurd, kan de chloor alle levende cellen vernietigen, en is er geen groei. In sommige gevallen is er geen wortelvorming, de samensteling van de bodem moet dan worden aangepast met een hogere concentratie wortelgroeistimulerende phytohormonen.Zo zie je maar, de technieken zijn voorradig en haalbaar, maar zeker niet eenvoudig toe te passen voor de amateur. Maar zelfs al wagen we ons niet aan deze kweek, nu weten we dank zij Peter de Batist hoe het er bij in-vitro-cultuur aan toegaat